液氮对于菌种细胞的冷藏保存处理

液氮，液态的氮气。是惰性的，无色，无臭，无腐蚀性，不可燃，温度极低。氮构成了大气的大部分（体积比78.03%，重量比75.5%）。氮是不活泼的，不支持燃烧。液氮超低温保藏就是将菌种密封在有保护剂的安瓿管内，经控制速度冻结后，在-150℃～-196℃液态氮超低温罐中保藏。

液氮罐

1.菌种制备

保藏孢子时，取孢子制成悬液，加入保护剂，装入无菌安瓿管内。保存菌丝体时，用液体振荡法培养菌丝球，或用平板培养菌丝体，也可用麦粒菌种。取适量放入无菌的装有保护剂的安瓿管内。

2.安瓿管

制作安瓿管的玻璃，要具有经受温度突变而不破裂、容易用火焰熔封管口、恢复培养时容易打开的特点。一般采用硼硅玻璃，管的大小根据需要而定，通常是75毫米×10毫米或能容1.2毫升液体的安瓿瓶比较合适。选好安瓿管后，每管加进0.8毫米保护剂，塞上棉塞，在1千克/平方厘米压力下灭菌15分钟，供冻结琼脂菌丝片或麦粒菌种用。如冻结孢子悬液时，则空管灭菌。

液氮杜瓦罐

3.保护剂

用体积比10%甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液作保护剂。

4.冻结保藏

将上述准备好的菌种以无菌操作移入加有保护剂的安瓿管中，用火焰将安瓿管上部熔封，浸在水中检查有无漏气。然后将封口的安瓿管放在慢速冻结器内，控制冻结速度，一般每一分钟降低1℃，使样品逐步均匀地冻结到－40℃。－40℃以下的冻结速度，可不用控制而迅速下降。安瓿管冻结后，立即放入山立牌液氮罐中。罐内的气相温度为－150℃，液体温度为－196℃。

液氮快易冷

5.恢复培养

需要使用保藏菌种时，将安瓿管从液氮罐中取出，立即放入33～40℃的水浴中振荡至管内冻结物全部融解，开启安瓿管，将管内菌种接入适宜培养基培养即可。早前常用的液氮罐的容积有10升、35升两种，也有更大的，如美国菌种保藏委员会（ATCC）使用的容积达250升和650升。常用的备用液氮罐容积为10～35升，也有100升的。由于液氮来源困难、液氮罐设备费用大，目前这种保藏方法还未广泛普及使用。

储存于阴凉、通风的库房。库温不宜超过30℃。储区应备有泄漏应急处理设备。密闭操作，提供良好的自然通风条件。操作人员必须经过专门培训，严格遵守操作规程。建议操作人员穿防寒服，戴防寒手套。防止气体泄漏到工作场所空气中。搬运时轻装轻卸，防止钢瓶及附件破损。配备泄漏应急处理设备。

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